实验室手册-第6节
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（1）P/N≥2。1 为阳性
（2） P≥N＋3SD 为阳性
成功范例：NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测 亚类鉴定和鸡白痢检疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法
（一） GA法
1、 新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌 浓度至1X10（6）个/ml。
注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；
2、 酶标板中加200ul/孔，5％戊二醛（GA）溶液（0。1M NaHCO4 95ml＋25％DNY戊二醛溶液5ml）；37（度）；2小时
3、 蒸馏水洗5次；
4、 加细菌悬浮液；50ul/孔；
5、 37（度）温箱内过液；干燥吸附（20—24h）
6、 加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；
7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；
8、 以下步骤同一。
（二） MA法
1、 细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；
2、 室温或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室温10分钟；
3、 加PBS/NCS封闭，37（度）3小时或4（度）过夜；
4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存备用）；
5、 以下步骤同一
成功范例：H单抗检测等。
三、用全细胞抗原的ELISA
1、 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染的细胞 ，进行细胞 计数，用PBS制成适当浓度悬液；
2、 加100ul/孔细胞悬殊浮液于酶标板内，使每孔含细胞5X10（）
3、 将板离心1000rpm10分钟，甩去上清，室温干燥（可保存在4℃或—20℃备用）；
4、 PBST冼3次，每次5分钟；
5、 每孔加100ul第一抗体或杂交瘤 上清，设立对照；
6、 37℃1—2小时；
7、 PBST洗3 次；
8、 每孔加入100ul酶标第二抗体，37℃1—2小时；
9、 PBST冼5次；
10、 每孔加入100ul底绶冲液，室温作用30分钟；
11、 判定结果。
成功范例：粘附素单抗，O抗原单抗检测等。
注意：若需要，可灭活细胞内源酶，以减少本底反应。其它方法参见本章第六节。
第二节 直接ELISA
1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方阵试验确定）包被标板（50—100ul/孔）；
2、PBS/NCS封闭板（保存备用）；
3、 每孔加50—100ul酶标抗菌素体；设立阴性、阳性对照；
4、 37℃孵育2h
5、 PBST洗5次，每次5分钟；
6、 以下同间接ELISA；
成功范例：沙门氏菌检验、抗血清效价测定、酶标抗体效价测定 等。
第三节 夹心ELISA试验
1、 单一或混合单抗腹水或纯化的免疫血清用包被液稀释后25—100ug/ml；（有人使用蒸馏水直接稀释腹水作包被）。
2、 以50—100ul/孔量加入酶标板中；
3、 置4℃过夜吸附或37℃吸附3h
4、 PBST 洗3次；
5、 PBS/NCS封闭，200ul/孔，4℃过夜或37℃3h；
6、 PBST洗涤5次，每次1min；（可于—20℃保存备用）；
7、 每孔加50—100ul待检抗原，同时设立阴、阳性对照；
8、 37℃孵育2h；
9、 PBST洗5次，每次5min；
10、 每孔加50—100ul酶标单抗或酶标纯化抗体；
11、 37℃孵育2h；
12、 PBST洗5次，每次5分钟；
13、 37℃孵育2h
14、 PBST洗5次，每次5min；
15、以下步骤同前。
成功范例：鸡新城疫病毒，大肠杆菌，沙门氏菌检测。
第四节 竞争ELISA试验
1可溶性抗原以包被液稀释至1ug/ml（需方阵滴定确定），（全菌抗原包被方法参见前述）；
2、50—100ul/孔，包被酶标扳；
3、4℃过夜吸附；
4、PBST洗3次。每次5分钟；
5、PBS/NCS封闭200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存备用）；
6、PBST洗3次，每次5分钟（可—20℃或4℃保存备用）；
7、 加50—100ul/孔待检血清样品，再加入50—100ul/孔单抗，设立对照；
8、 37℃孵育1—2h；
9、 PBST洗5次，每次5分钟；
10、 每孔加OPD50—100ul；
11、 37℃避光作用10—20min；
12、 以100ul/孔加2M H2SO4终止反应，测定OD490；
13、 判定结果：
（1） 抑制率（N—P/N）》50％判为阳性；
（2） OD490值《NCX Ⅹ0。3＋PCX X 0。7为阳性（PCX为阳性对照的平均值；NCX为阴性对照的平均值）。
成功范例：检测伤寒、鸡白痢抗体等。
第五节 Dot—ELISA
1、 根据实验要求不同，选用硝酸纤维膜，混合膜或醋酸膜，并切成条带，以硬模压痕迹；
2、 以蒸馏水或TBS浸泡膜条带，取出晾干后备用；
3、 抗原包被：
（1）、可溶性抗原（ug/ul），每点点加5ul，37℃烘干；
（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每点点加5ul；37℃烘干，可先将条带经5％GA处理后，37℃3h或4℃过夜，再加样烘干。
4、 TBS/NCS或BSA封闭；
5、 漂洗；
6、 将膜转入酶标抗体内，37℃0。5…2h；（间接法步骤是：先于第一抗体中浸染漂洗后，转入酶标第二抗体中反应）。
7、 漂洗；
8、 把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中显色，室温10—30分钟；
9、 漂洗；
10、 晾干后，判读结果（可以进行扫描分析）。
成功范例：脂多糖抗原检测，大肠杆菌检测 ，单克隆抗菌素体筛选等。
第六节 酶标组化法
1、 抗原准备：
（1） 细胞涂片：
（2） 病变组织触片或冰冻切片；
（3） 生长细胞的培养孔或玻片；
2、 4℃丙酮固定10分钟；
3、 灭活内源酶：
将待检玻片浸入内源酶灭活液内，或于培养孔内加入内源酶 灭活液，室温灭活30分钟，弃去灭活液，以PBS和去离子水充分洗涤10—20分钟，自然干燥；
4、 以PBS/NCS封闭，37℃2小时或4℃过夜；
5、 酶染：加酶标抗体反应（或间接法步骤进行）37℃1—2小时，并设立对照；
6、 PBS洗15分钟表；
7、 以DAB显色，室温避光30分钟；
8、 镜检：细胞浆呈棕黄色，细胞 核无色，阴性对照无色，判为阳性。（4—氯—1—萘酚 显色）。
成功范例：猪瘟组化法诊断。
第七节 ELISA常用溶液的配方
一、 包被液
1、 碳酸盐绶冲液
0。2M Na2CO3： 12g无水Na2CO3＋100ml去离子水
0。2M NaHCO3：1。68g NaHCO3＋100ml去离子水
取0。2M NaCO3：8ml，0。2M NaHCO3：17ml混合再加75ml去离子水；调PH至9。6。
2、 Tris—HCL绶冲液（PH6。0；0。02M）
0。1N Tris 100mｌ
0。1N HCL 58。4ml
培养离子水加至1000ml
（Tris MW 121。14）
3、 其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，请参阅有亲章节和文献。
二、稀释和封闭液
1、 EPBA（PH7。2）
NaCL 80g Na2HPO4。12H2O 14。5g
KCL 2g KH2PO4 2g
去离子水10升
2、 EPBS/Tween—20/NCS：
EPBS＋0。05％Tween—20＋10％NCS or ！％BSA
3、Tris—HCL绶冲液 PH7。0 0。01M
0。1M Tris 50。0ml
0。1N HCL 46。5ml
NaCL 8。5g
BSA 50g
正常山羊血清150ml檬酸：
去离子水1000ml
三、洗涤液
1、 EPBS/Tween—20
EPBS＋0。05％Tween—20（或80）
2、 Tris—HCL/Tween PH7。4 0。02M
1。0M Tris 20ml
1。0N HCL 15ml
1。0N HCL 15ml 调PH至7。4
Tween—2。0 0。5ml
DW 加至于1000ml
四、底物溶液
1、 磷酸盐—柠檬酸绶冲液（NO。1）
0。1M 柠檬酸：10。5g C6H6O7。H2O＋DDW500ml
0。2M Na2HPO4。12H2O＋DDW1000ml
取24。3ml0。1M柠檬酸、25、7ml0。2M NaHPO4再加50mlDDW
注：柠檬酸溶液 及配成的底物绶冲液不稳定；易形成沉淀；因此一次不宜配制过多。
2、 OPD（邻苯二胺）底物
NO。1底物绶冲液 10ml
OPD 4mg
3％H2O2 40ul
3、 TMBS（四甲联苯胺硫酸盐）
TMBS贮液：10mg/ml DMSO 4℃避光存放。
TMBS贮液 100ul
NO。1底物绶冲液 10ml
1％H2O2 25ul
4、0。05M PH 7。6 Tris_—HCL缓冲液
0。1M Tris 50ml
0。1N HCL 38。5ml
DW至100ml
5、TBS buffer （NO。2
20 Mm Trisbase
500Mm NacL
adjusted to PH7。5 With HCL
6、 DAB（二氧基苯胺盐酸）底物
DAB 75mg
NO。2底物绶冲液100ml
避光搅拌3小时；使其溶解；滤纸过滤。临用前加1％H2O2 0。5ml
7、4—氯—1—萘酚底物（4CN）
（1） 4CN贮液：3mg 4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；
（2） 使用液：2ml 4CN贮液＋10mlTS buffer＋H2O2至0。01％（V/V）
7、 酶反应终止液
2m H2SO4
浓H2SO4 10ml溶于80ml DW
六、内源酶灭活液：
0。01％H2O2；NaN；PH7。6 0。05M Tris—HCL绶冲液：
取PH7。5 0。05M Tris—HCL绶冲液98ml，加1％H2O21ml 1％ NaN 1ml即成。
第八节 酶标抗体的制备
一、 1、 试剂
1、 0。1M NaHCO3：0。84gNaHCO3＋DDW 100ml
2、 0。1M Na2CO3：1。06g Na2CO3…DDW 100ml
3、 EPBS：同第七节
4、 10mM NaIO4 204。0mg NaIO4＋DDW 100ml
5、 0。1mM NaOH
6、 5mg/ml NaBH4：0。1g NaBH4＋0。1mM NaOH 20ml
二、 HRP直接标记腹水中单抗
1、 5mg HRP溶于0。5ml 0。1M NaHCO3
2、 加0。5ml 10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞
3、 室温（20℃）避光作用2h
4、 加0。75ml 0。1M NaCO3，混匀
5、 加0。75ml小鼠腹水，混匀
6、 用少许PBS将交联物转移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中
7、 加Sephadex G15或50干粉0。5g，混匀。盖紧，室温作用（避光）3h
8、 用少许PBS将交联物全部洗出
9、 收集洗出液，加1/20V新鲜配置的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟
10、 再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h或4℃过夜
11、 将交联物过Sephdex G200或Sepharose 6B（2。5*50cm）层析纯化，分管收集第一峰
12、 酶结合物质量鉴定：
（1） 克分子比值测定
酶量（mg/ml）=OD403*0。4
Ig量（mg/ml）=（OD280…OD403*0。3）*0。62
酶结合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量
标记率=OD403/OD280
E/P值为1…2之间合格
（2） 特异性及效价测定：应用ELISA同时确定酶结合物的特异性，酶活力，抗体活性及效价。
将酶结合物对倍稀释后平行加于阴性孔及阳性孔，合适底物显色后记录各个稀释度的特异及非特异显色值，绘制特异及非特异反应曲线，比较二条曲线可以确定其特异性，酶活力及抗体活性。特异显色为1。0时的稀释倍数，一般可作为交联物的效价。实际使用浓度应适当升高2…5倍。
13、 酶标记抗体的保存：加等量甘油（A。R）后，…20℃存放。
三、 HRP标记提纯抗体制剂：（纯化抗体请参见有关章节）
（一） HRP 的活化
1、 5mg HRP（RZ》3。0）溶于0。5ml新配制的0。1M NaHCO3试管中；
2、 在上述溶液中加入0。5ml 10mM NaIO4，试管加塞塞紧，20℃暗处放置2h
3、 加0。1ml 0。1M Na2CO3以减慢氧化
（二） 标记
1、 用0。1M Na2CO3（Ph9。2）（1…2ml）配制15mg Ig溶液
2、 将Ig溶液加入HRP溶液（HRP：IgG分子比为1：2）
3、 立即将IgG…HRP混合液移入5ml注射器外筒（下口塞有玻璃棉，并接上橡皮帽），加入混合液重量的1/6 Sephadex G25或50干粉；室温3h或4℃过夜
（三） 稳定化
1、 用少许PBS洗脱酶标记物
加入1/20V的NaBH4酶标记物中；室温作用30分钟，加入3/20V的NaBH4，室温作用1h（可与4℃过夜）
（四） 提纯同前。
（五） 酶结合物质量鉴定及保存，同前。
成功范例：酶标记大肠埃希氏菌粘附素单抗，沙门氏菌O、H抗原单抗，NDV单抗，羊抗鼠Ig抗体等。
第五章 免疫荧光试验程序
第一节 间接免疫荧光试验
一、 抗�
