实验室手册-第5节

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　　　　　　　　　　　　NaHCO3　　　　　　　　　　　　　　3。7g　　　　　　　　S。P（100X）　　　　100ml
用1NHCl调至7。2_7。4；　过滤除菌；分装后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（…5）M　　MW=440。4）
1。76mg　A＋90ml双蒸水＋0。5ml　1N　NaOH助溶，双蒸水加至100ml＋0。5ml　1N　HCl中和；0。22um滤膜过滤除菌；分装2ml小瓶；…20℃保存。
三、 100XHT
Hypoxanthine：MW　136　　　　10（…5）M　solution
Thymidine：　　　MW242。2　　　1。6X10（…1）M　solution
H和T可以配在一起，136。1mgH＋100ml双蒸水＋1N　NaOH至H溶解；加T38。8mg；把PH用醋酸调至9。5；　0。22um滤膜过滤除菌；…20℃保存。
四、 100Xglutamine　200Mm　　Solution
2．92g　　　　　　　　glutamine
100mlDMEM基础液，；37℃助溶液
0。22um滤膜过滤除菌；分装2…5ml小瓶，…20℃保存。
五、融合剂配制：PEG（Baker　1000）20…50g于三角瓶中，盖紧，60…80℃水浴融化，0。6ml分装于青链霉素小瓶中，高压蒸汽灭菌，…20℃保存备用。临用前加热融化，加等量DMEM基础液，用少许5。6％NaHCO3调PH至8。0。

第三节 单抗制备技术中的其它方法
一、杂交瘤细胞的克隆化
1、 制备小鼠腹腔细胞；
2、 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液；用不着5…20％血清的HT培养基稀释后使每毫升含2。5、15、50个细胞3种不同的稀释度。
3、 按每毫升加入5X10（4）…5X10（5）个细胞的比划，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔细胞；
4、 每种杂交瘤细胞分装货6孔板一块，每个稀释度32孔，每孔的量为0。2ml，每孔的杂交瘤细胞分别为0。5、3、10。（或将士、3、4步改为配制15毫升HT培养基中含100个细胞，加入腹腔细胞后分装96孔1块）；
5、 37℃，7。5％CO2湿润培养基7—10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；
6、 在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
7、 取阳性的细胞扩大培养，并冻存。
二、 细胞冻存和复苏方法

1、 将对数生长期的杂交瘤细胞或其它细胞　离心，重新悬浮于预冷的冻存液中（其中含10—20％小牛血清，10％DMOS的HT培养基），浓度至少5X10（6）/ml。
2、 分装安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、 封口后，将发瓶入入一带收口绳的小布袋内，立即将布袋放入内衬石棉的百铁筒内，置—70℃冰箱。
4、 2—4小时后，或过夜后，将布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存时间不宜过长，一般不超过24小时。
5、 复苏细胞时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一点冰快要融化时，从冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT培养基稀释，离心后，再悬浮于适量培养基中，装瓶，置37℃含7。5％CO2培养箱中培养。
6、 如细胞存活率不高，可加腹腔细胞　进行培养。
7、 细胞　存取均应为高，可加腹腔细胞进行培养。
8、 细胞存取均应做好记录。
三、 单抗的大量生产
1、 腹腔接种降植烷（Pristane）或液体石腊，每只小鼠（2月龄以上）0。5ml。
2、7—10天后腹腔接种PBS稀释的杂交瘤细胞，每只鼠5X10（5）/ml0。2ml。
注意：每只鼠接种细胞　数不可太多或太少，否则单抗菌素产量不高。
3间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨起，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2—3次，通常每只小鼠可采5—10ml腹水。
　　　　
5、 离心，去除细胞　成份和其它沉淀物，测定抗体效价，可加防腐剂（0。01％硫柳汞或者说％叠氮钠）小量分装；—70℃保存。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第三章组织培养使用物品的准备
1、 器材用后立即浸泡是很重要的事；
2、 分类洗涤、处理是必要的，不妨可分为不与细胞直接接触的器材和与细胞　直接触的器材，它的洗刷条例不尽一致；
3、 厉行节约，可以重复使用的器材不应废弃；
4、 需要特殊处理的器材，如病原材料污染的器材物品，须协助洗涤人员作无害化处理；
5、 高压消毒或高温干烤器械时，务必有人在场。
第二节 玻璃器皿的准备
1、 规格：组织培养用的玻璃器皿要求严格，以中性硬质玻璃为适宜，用于培养细胞　的培养瓶更应注意选择，一般常用的细胞　培养瓶有链霉素瓶，方形、园形克氏瓶等。蜕2瓶的接种面应平坦，瓶口内径力求光滑或正方形，防止瓶塞塞后漏气。其它培养中弯头吸管、试管、盛液瓶、平皿、吸管和注射器一般常用即可。
2、 洗涤
用过的玻璃器皿，先用清水冲洗，再以肥皂或中性洗衣粉水洗干净，浸泡于洗涤液中1—2日，取出后自来水冲洗7次，再用双蒸水或去离子水三盆，分盆冲洗5次，并在双蒸水或去离子水中浸泡过夜，晾干或烘干，包装消毒。新购置的玻璃器皿在25％的浓H2SO4或3％的稀盐酸中浸泡过夜，再进行以上洗涤、晾干、包装、消毒。　　　
3、 包装、消毒
小培养瓶或链霉素瓶可放在普通铝制盒中，吸管在塞上棉塞后放在玻璃或金属筒中消毒。盐水瓶用牛皮纸包口后，160℃2小时，干热灭菌。
第三节 橡皮朔料制品的准备
1、 规格：
选用质软能耐高压，对细胞　毒性小的橡皮塑料制品。
2、 洗涤：
新的橡皮塞和橡皮管首先在1％NaOH中煮沸30分钟，然后用自来水冲洗5—7次，用双蒸水冲洗3次，再用双蒸水浸泡过夜色。用过的橡皮塞洗净后，以双蒸水煮沸30分钟，晾干，包装消毒。
3、 包装灭菌：
将洗涤、晾干的橡皮塞放在小铝盒内或培养皿内。其它橡皮制品用纸包好，15P20—30分钟。
第四节 其它用品的准备
一、 滤过用布：指麻布或娟布，剪成小块，浸于丙酮中，在室温经48小时，取出洗涤，以双蒸水洗3次，干燥灭菌备用。
三、 解剖用具：外科剪、镊等，可用干燥灭菌，160℃2小时或于使用前煮沸消毒
5—10分钟，每次用完后洗涤擦干。
附1　　　　洗液配方
　　　　　　　　配方1　　　重铬酸钾　　　　　　　　150g

　　　　　　　　　　　　　　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　300ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　浓硫酸　　　　　　　　　　30000Ml
　　　　　　　　将重铬酸钾沸水溶解，然后慢慢加入浓H2SO4，边加边搅拌，见发热过剧则稍停，冷却后继续加，此为强洗液。
　　　　　　　　配方2　　　　浓硫酸　　　　　　50％
　　　　　　　　　　　　　　　　　蒸馏水　　　　　　　50％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　重铬酸钾　　　　5％
　　　　　　　　此为中等强度洗涤液
　　　　　　　　配方3　　　　重铬酸钾　　　　　　100g
　　　　　　　　　　　　　　　　　蒸馏水　　　　　　　　　1000ml
　　　　　　　　加热溶解，冷却后缓慢加入工业硫酸100ml，此液为弱洗液，为棕红色，使用此液时，必须预热先用肥皂水将玻璃器皿洗净，经自来水冲洗沥干，然后才能浸入，否则该洗液很快失效。
　　　　　　　　　盛洗涤液的容器要坚固，操作时要穿橡围裙，长筒胶靴，戴上眼镜和厚橡胶手套，以保安全。
　　　　　　　　　洗涤一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用。如将这样的洗液加热，再加适量重铬酸钾，可重新使用。
附2、玻璃器皿的硅化处理可以防止细胞粘附或提纯物质损耗在离心管可吸管上。下述的是溶硅的操作条例。
1、 工作液由1份硅胶加100份水制成。如要硅化大约24个15ml的离心管和200个用后便丢弃的巴氏吸管时，可准备600—800ml的工作液。
2、 在硅化前所有玻璃器材必须清洁和干燥，将溶液倒入离心管，放置至少5分钟。倾出，水冲洗2—3次。将巴氏吸管放满一个大烧杯，将硅胶倾倒在它的上面，直至所有吸管都有充满为止。放置至少5秒钟，将溶液倾出，用水彻底冲洗吸管。工作液不可再用。
3、 室温中气干器皿24小时，放入玻璃器皿干燥箱内，时间可较短。
第五节 纯水制备程序
1、 细胞培养用水必须使用三蒸馏或四蒸馏水，而大多数去离子水和常规一次蒸馏水一样不适于作为与细胞接触之用。
2、 四蒸水的制备，通常用去离子水，在双重石英蒸馏器中蒸馏2次，以达到纯净的目的。
3、 去离子水通常用一次蒸馏水，经离子交换树脂处理，并检查水质情况：水质清亮，一般电阻大约10万欧姆/cm，最高可达100万欧姆/cm；5％AgNO3检不出氯离子，PH8—10。
4、 离子交换柱必须安装在环境温度最高不超过40℃，最低不能低于0℃地方。
5、 新树脂预处理方法：
（1） 工业性生产的离子交换树脂出厂时难免有一些杂质，在使用前应先用清水冲洗，洗至水质清亮。
（2） 用4％HCL、4％NaOH（浓度不能超过6％）交替处理，在酸碱之间大量水洗，如此反复处理三次，即：酸一水，碱一水，反复进行，每次酸碱用量为树脂体积的2倍。在交换柱中动态进行，如在容器中处理应采取少量多次。
（3） 最后一次，阳性树脂应用酸处理使其成为H　型，所用酸量应加倍，水洗手去离子水。阴性树脂应用碱处理使其成为OH型，所用碱量应加倍，水洗用去离子水。
6、 经常以4—5％HCL再生阳性离子柱，（001X7强酸树脂）用量为树脂体积的2—3倍。以
　　　　　4—5％NaOH再生阴离子柱。（201X7强碱树脂）。
　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　　　附：A实验室用纯水质量表

　　　


精制方法
精制水的电阻率（欧姆。厘米）
纯水的理论值
蒸馏水
玻璃容器一次蒸馏
玻璃容器三次蒸馏
石英容器三次蒸馏
石英容器23次蒸馏
复床式
混合床式

1。83X10（7）
1。0X10（6）
5。0X10（5）
1。0X10（6）
2。0X10（9）
1。6X10（7）
1。0X10（4）
1。8X10（7）

　　　　　　　　　　　　附B实验室分析用水标准

序号

项目
指标
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 外观
PH
蒸发残渣（mg/l）
灼烧残渣（mg/l）
氨及铵盐（NH4）（ng/l）
碳酸盐（CO2）（mg/l）
硫酸盐（SO4）（mg/l）
氯化物（CL）（mg/l）
硝酸盐（NO2）（mg/l）
硅（mg/l）
钙＋镁（mg/l）
重金属（mg/l）
导电率（Ω） 无色透明，无臭无味
5。4—6。6