实验室手册-第4节

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4 、溶液应灌装在硬质耐热的玻璃容器内，不要灌装得太满，一般灌至容器的1/2~3/4容积。
5 、不允许将不同类型不同消毒要求的物品放在一起消毒。
6 、每周将安全阀开放数次，这样可以保证安全阀处于良好的灵活状态。
7 、压力表使用日久后会使读不准确，应检修或换上新表。
8 、平时注意消毒器的清洁干燥，可以延长使用年限。
9 、消毒过程中操作者最好不要离开现场，若要离开，一定要交待他人代为看管。
10 、不同物品消毒所需时间、温度与压力：
消毒物类　　　　　　消毒所需保温　　　　　　　蒸汽压力　　　　　　　表　压　　　　　饱和蒸汽相　
　　　　　　　　　　　　　　时间（分钟）　　　　　　（公斤/厘米）（碳/英寸）　　　对温度（　）　　　
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橡胶类　　　　　　　　15　　　　　　　　　　　　　　　　1。05　？1。1　　　　　　　　15？16　　　　　　　　　121　　　　
敷料类　　　　　　30？45　　　　　　　　　　　　　　　1。05？1。4　　　　　　　　　15？20　　　　　　　121？126　　　　　
器皿类　　　　　　　　15　　　　　　　　　　　　　　　1。05？1。4　　　　　　　　　　15？20　　　　　　　121？126
器械类　　　　　　　　10　　　　　　　　　　　　　　　1。05？1。4　　　　　　　　　　15？20　　　　　　　121？126　　
瓶装溶液类　　20？40　　　　　　　　　　　　　　　1。00？1。4　　　　　　　　　　15？20　　　　　　121？126　　
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三、 其实各类仪器使用前请详细阅读使用说明书，这里不在一一介绍。




　　　　　　　　　　　　　　　　第三部分　　实验室常规试验程序
第一章　组织培养及常用溶液的配制
第一节 鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞（DEF）培养
一、 材料
9？10日龄鸡胚　　13？14日龄鸭胚　　　眼科剪、　镊、外科镊　、巴氏吸管　、蛋架、灭菌平皿　　　25ml小三角瓶　　Hanks＇液　　0。25％胰酶液　　Versene液　　灭菌纱布、玻璃漏斗、0。1％　结晶柠檬酸（0。1M）或0。4％台盼兰；血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。　　　　　　　　
二　方法（CEF为例）
鸡胚　理：取9？10日龄鸡胚直　　于蛋架，在气室部用于5％碘酊棉　消毒，再用洒精棉　脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1…2mm的碎块，加Hank’s液20ml；略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、 消化：将0。25％胰蛋白酶溶液用5、6％NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。必须注意每次吹吸一般6—7次为宜　，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、 细胞计数：
取细胞悬液0。1（100ul）置盛有0。9ml10。4％台盼蓝的试管中混合；用血球计数板计数。
计算方法：　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4大方格细胞数
每ml细胞数=——————————————X10（5）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4
　　　　　　　　　　　　　　　5中格细胞数
或每ml细胞数=——————————X10（4）
三：接种
以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm　　dish（10ml），60mm　　dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
四、CEF单层可供作病毒TCID50LD50等指数的测定；空斑计数病毒中和试验等。

第二节　溶液配方
一、PBS

1、无钙镁PBS
　　　　　　　　　　　　　　　　　　50X　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Less　NaCl）
1000ml　　　　　　　　　　　　　　　　双蒸水
10g　　　　　　　　　　　　　　　　　　　KCl
　　60g　　　　　　　　　　　　　　　　KH2PO4
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　60g　　　　　　　　　　　　　　　　Na2HPO4（Na2PO4。12H2O　151g）
溶后分装20ml管，…20　保存
20ml　　　　PBS　　　　　base　　　50X
8g　　　　　　NaCl
0。3ml　　　　0。5％酚红
980ml　　　　双蒸水　　　　　　　　　　　　　　15P　　　　11分钟
2、NaCl　　　　　　　8。0g
　　　KCl　　　　　　　　0。2g
　　　CaCl2　　　　　　0。1g
　　　MgCl2　　　　　　0。1g
　　　Na2HPO4　　　1。15g（Na2HPO4。12H2O　；　　　2。92g）
　　　KH2PO4　　　　　0。2g
双蒸水至100ml；　过滤除菌，50保存。
3、 分别配制A、B、C原液
A液：　NaCl　　　　　　　　　80。0g
　　　　　　　KCl　　　　　　　　　　2。0g
　　　　　　　KH2PO4　　　　　　2。0g
　　　　　　　Na2HPO4。2H2O　　　　　　14。4g（Na2HPO4。12H2O　　　29。0g）
　双蒸水至800ml
B液：CaCL2　　　　　　0。5g
　　　　　　双蒸水　　　　　500ml
C液：MgCl2　　　　　　0。5g
　　　　　　双蒸水　　　　　500ml　
以上三液分别　10P10’高压蒸气灭菌，冷却后
A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　80V
B　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100V
C　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100V
H2O　　　　　　　　　　　　　　　　720V
无菌混合
注意：
　　　各化学药品的结晶水重量是否扣除！
二Hank’s　　Solution
　　　分别配制　A、B原液
A液：NaCL　　　　　　　　160。0
　　　　　　KCl　　8。0　　　加入800ml双蒸水　　　　　
MgSO4。7H2O
MgCl2。6H2O　　　2。0
　　　　　　CaCl2　　　　　　　2。8（溶于10ml双蒸水）
双蒸水加至　1000ml　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
B液：Na2HPO4。12H2O　　　　　　3。04g
　　　　　　KH2PO4。2H2O　　　　　　　　1。2g　　　　　　800ml双蒸水
　　　　　　Glucose　　　　　　　　　　　　　　　20。0g
0。4％酚红液100ml
双蒸水至1000ml，2ml氯仿防腐，4保存。
A　　　　1V　　　10P　　　10min　　　灭菌
B　　1V　　10P　　10min　　灭菌
双蒸水　　18V　　10P　　10min　　灭菌
1…4保存，可用１个月。
用5。6％NaHCO3（10P　　10min　　灭菌）或3。5％，调PH至7。2—7。6（加NaHCO3后须立即使用）。
三、0。4％酚红液。　　　　　　　　　
　称酚红0。4g→置乳钵滴加0。1N　　NaOH（总量11。2g/ml）并不断研磨→所有颗粒全部溶解→100ml量瓶，将已溶后的吸入，用双蒸水洗钵数次，倒入→加双蒸水至100ml摇匀，4℃保存。

四、 Versene液
乙二胺四乙酸二钠（Versene）　　0。2克
NaCL　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8。0克
KCL　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0。2克
NaH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1。15克（NaH2PO412H2O=2。9）
KH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0。2克
双蒸水至1000ml；10P’；10’灭菌；4℃保存；可用3个月。
五、 胰酶液Tryptase
一般配成0。25％
取0。25克溶于100mlHank’s滤过除菌；分装小瓶。…20℃保存。用前融化加入青链霉素100单位/ml并用5。6％NaHCO3滴定至PH7。4…7。6
注意：
1． 为避免消化细胞成团，可配无钙胰酶液．
2． 胰酶威无臭无味的白色粉末，应密封保存，阴暗处防潮解，可分装小瓶保存．
3． 胰酶液的浓度随其活力和消化细胞的来源和种类而定．一般消化配组织用0。1％。
六。碳酸氢钠液
取NaHCO35。6克溶于100ml双蒸水中；使完全溶解后；经滤纸过滤后；分装于瓶中（5ml或2ml）10P；10’灭菌。塞紧胶塞；贴上标签；注明批号日期；4度保存备用。（在4度应为透明液；不得有沉淀）。每瓶开启后使用不得超过2次。
七。0。5％乳蛋白水解叶（LAH）
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中；根据需要分装50…100ml瓶；立即10P；20’灭菌；4度保存备用；用前；用5。6％　NaHCO3滴定PH7。4…7。5。
注：乳蛋白水解物极易潮解；平时必须将瓶塞紧；最好储存于干燥器中；乳蛋白水解物含有丰富的营养成分。0。5％乳蛋白水解物溶液加入适量抗生素和血清；即可用于一般的细胞培养。
（一）。CEF培养
0。5％LAH
CS　　　　　　　　　　5％
Pen　　　　　　　　　　100unit
Str　　　　　　　　　　　100ug/ml
5。6％　NaHCO3调PH至7。2…7。4
（二）PK细胞培养
0。5％LAH　　　　　　　89。5％
CS　　　　　　　　　　　　　10％
Pen/Str　　　　　　　　　100unit/100ug/ml
八。Earle’s液
甲液：NaCL　　　　　　　　　　68g
KCL　　　　　　　　　　　　4g
　　　　　　　　NaH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1。4g
　　　　　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　10g
双蒸水至500ml；溶解后加氯仿1ml防腐
乙液：CaCL2　　　　　　　　　　　　　　2。0g
　　　　　MgCL2　　　　　　　　　　　　　　1。7g　
0。4％酚红50ml
双蒸水加至500ml；0…4度保存备用；按比例配成Earle’s液。
　甲　　　　　1V　　　　　　　10P　　　10’灭菌
　乙　　　　　1V　　　　　　　10P　　　10’灭菌
　双蒸水　10V　　　　　　10P　　　10’灭菌
4度保存备用；用前用5。6％　NaHCO3调PH至7。4…7。5
九。抗菌素溶液（Pen/Str）
用灭菌双蒸水配制每毫升含
Pen（青霉素）10；000units
Str（链霉素）10；000ug
分装小瓶；…20度保存。一般培养液加这种Pen/Str％；最终浓度为100unit/ml。
十、199—F10生长液
199 　　　　　　　　5。49g（4。95g）
　　　　　F10　　　　　　　　　4。9g
　　　　　NaHCO3　　　　　1。7g
　　　　　S。P　　　　　　　　　　　1ml（10万U/ml）
　　　　　BFS　　　　　　　　　　40ml
　　　　　DDW　　　　　　　　　至1000　ml
过滤后分装备用。
199…F10维持液：BFS仅用10ml；余者同上
　　
　　　　　　　　　　　　　　第三节　　　配制溶液的注意事项
1使用化学药品为A。R。级；标签清楚；最好组织培养专用；防止使用和保存过程中的混淆和污染。
2。配制溶液的用具；需经严格洗刷和消毒；其配制过程尽量在无菌操作下进行。
3。称量药品应力求精确。配制溶液应有详细记录以及消毒，保存；分装和使用情况。
4。配制的每批溶液；需经试用后；方可大量使用。因此需提前配制溶液。溶液保存有一定期限；保存时应经常检查；发现可疑现象和过期；不得使用。
5。注意节约；计划用多少就配多少。
　　第二章　　淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节 融合程序
融合方法：　
1、 将108　脾细胞与2—5x107　SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基础液；
2、 1000r/m离心5分钟；
3、 吸净全部培养液；
4、 在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块，置400C水浴中预热；
5、 用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50％PEG（PH8。0）1ml，边加边搅；
6、 用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟；
7、 1000r/m5分钟；
8、 弃尽上清，轻击离心管底以分散细胞积块，重新悬浮于80—100mlHAT培养基中；
9、 按比例加入107　　—2X77　　腹腔细胞（约2只小鼠）；
10、 分装96孔细胞培养板，每孔0。10__0。15ml；24孔板，每孔1。0__1。5ml；
11、 7。5％CO2；37℃孵箱里培养；
12、 5天后HAT培养基换出1/2培养液；
13、 7__10天后用HT培养基换出HAT；
14、 经常观察杂交瘤细胞生长情况；待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
15、 其它详细资料请参阅刘秀梵教授编。

第二节 溶液配方
一、 基础培养液：
1、老配方　　　　　　DMEM　　　　　　　　　　13。37g＋1000ml双蒸水使之溶解
　　　　　　　　　　　　　　　丙铜酸钠　　　　　　　　　0。11g
　　　　　　　　　　　　　　　碳酸氢钠　　　　　　　　　　3。6g
　　　　　　　　　　　　　　　　pen/str　　　　　　　　　　　20万/2　　　
0． 22u过滤，分装，4℃保存（不超过1个月）
2、新配方　　　　　　　DMEM基础液：
　　　　　　　　　　　　　　　　四蒸水　　　　　　　　　　　980ml　　　　　　　　NaHCO3　　　　　　　3。7g
　　　　　　　　　　　　　　　　DME（Giboo）　　　　　　13。37g　　　　　S。P（100X）10ml（本实验室用1支庆大霉素）
　1NHCl调试PH至7。2_7。4（本实验室用1NnaOH调至7。2_7。4）；过滤除菌；分装后4℃保存。
3、 DMEM完全培养基：
　　　　　30mlDMEM基础液中加15…20ml　BFS，1mlL…G（100X）即为完全培养基。
4、 HT培养基
　　　100mlDMEM完全培养基中加入100X　HT　　　1ml即成，或按下列配方直接配制：
　　　　　　　　　　　　四蒸水　　　　　　　　　　　　　　　　980ml
　　　　　　　　　　　　DME（Giboo）　　　　　　　　　　13。37g　　　　　L。G（100X）　　　　10ml
　　　　　　　　　　　　HT（100X）　　　　　　　　　　　　　10ml　　　　　　BFS（NCS）　　　　150_200ml
　　　　　　　　　　　　NaHCO3　　　　　　　　　　　　　　3。7g　　　　　　　　S。P（100X）　　　　100ml
用1NHCl调至7。2_7。4；　过滤除菌；分装后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（…5）