实验室手册-第14节
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表2所示HA价为1：256
表3 HI…试管法（单位：ml）
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀释倍数 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 对照
尿囊液 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 弃0。5
1：5稀释的抗NDV血清 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
混匀；置室温30分钟
0。5％鸡红血球 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
混匀置室温20…30分钟观察结果
结果举例 … … … … … ＋ ＋＋ # …
表3所示HI价为1：160
表4 HI…微量法（单位：滴）
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 1：256 1：512 1：1024 1：2048 对照
尿囊液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 弃1
抗NDV血清 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀；置室温30分钟观察结果
0。5％鸡红血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀；置室温20…30分钟
结果举例 … … … … … … … ＋ ＋＋ ＋＋＋ # …
表4所示HI价为1：128
注：若HA价是1：320；则0。5ml1：160稀释的尿囊液中含2iu病毒，0。5ml1：80稀释的尿囊液中含4iu病毒；0。5ml1：40稀释的尿囊液中含8iu病毒。
HI试验用搞原直接稀释血清法；表3和表4中；第1管（孔）用0。5ml含水8个iu病毒的尿囊液；第2—4管（或2—12孔）用0。5ml含4个iu病毒的尿囊液。
四、思考题
１、 什么叫血凝价（HA价）？什么叫血凝单位？什么叫血凝抑制价？
２、 为什么诊断ND要做HI 试验？
３、 HA和HI试验在家畜传染病学上应用有哪些？
４、 为什么NDV具有自动解凝现象？解凝后的红细胞能否再被NDV凝集？
５、 如何判定HA和HI试验结果？
IV、 示教试验
１、 NDV单抗分型试验（IIF）？
２、 单抗夹心ELISA试验检测NDV。
实验六 鸡马立克病的琼扩诊断
一、 目的
掌握琼脂板的制作方法和利用双向琼扩试验诊断ND。
二、 实验器材
干净大平皿 打孔器 打孔图纸 16号针头 7号针头 磨平针头
剪刀 镊子 试管 架 搪瓷盘 天平 铝锅 电炉 玻棒
10ml吸管 毛细滴管 滴头 红铅笔 橡皮膏 湿盒 阳性羽根
琼脂粉 氯化钠 量管 蒸馏水 示教平板
三、 实验步骤
（一） 琼 脂板制备
１、 称取琼脂粉4g，NaCL 400g铝锅内加蒸馏水500ml，煮沸溶化。
２、 浇琼脂板，每只直径90mm平皿倾注溶化的0。8％琼脂液18—20ml；然后将平皿置于水平的桌面上；使其自然凝固成厚度均匀的琼脂平板。
３、 按试验的需要打孔，烫孔。
（二） 羽根琼扩试验
１、 按打孔图纸所示模式打孔，烫 孔。
２、 每只受检鸡拔取6根新羽（最好是羽根带血的新羽），剪下羽根，长约0。5ｃｍ。
３、 在孔内加抗MD阳性血清。
４、 距血清孔内约3mm的四周上均匀六点垂直插入同一只鸡的六根羽根，并做阳性羽根对照。在平皿壁上标记受检的号码。
５、 平皿置湿盒中，于37℃进行扩散。
６、 24小时后观察结果，同一只鸡的六根羽根只要有一根与抗MD阳性血清孔间出现沉淀即可判定为MD阳性鸡。
（三） 血清琼扩和羽根浸液琼扩试验
１、 受检鸡血清分离
以带20号针头的1ml玻璃注射器从鸡翅静脉采血约0。5ml注入灭菌试管，也可以刺破静脉后，将一灭菌试管靠近流血处使血流流入试管约0。5ml，将试管摆成斜面，待血凝固，血清析出，供实验用。
２、 羽根浸液的制备
将受检鸡新生羽根10条放在小试管内，加生理盐水约0。5ml，用玻璃棒轻压羽根，使囊内的MDV浸出，上清液供实验用。
３、 按打孔图纸模式打孔、烫 孔，共九个区。
４、 实验程序
（1） 血清琼扩
将MD诊断抗原液加入中间孔，受检鸡血清加入周围孔，每个检样用一孔，并设抗MD 阳性血清对照，每区最接近平皿壁的孔定为第1孔，由此按顺时针方向定为2、3、4、5、6孔，在记录本上记下与孔号相对应的鸡号。
（2） 羽根浸液琼扩
将MD阳性血清加入中间孔，受检羽根浸液加周围孔，每个检样用一孔，并设阳性MD 抗原对照，记录鸡号的方法，同血清琼 扩。
５、 将平皿置湿清加入中，于37℃进行扩散。
６、 24小时后观察实验结果，出现沉淀线则为MD阳性鸡。
四、 思考题
１、 羽根琼扩和血清琼扩各适用于何种月龄 的鸡的MD诊断？为什么？
２、 血清琼扩在实际工作中还可用于哪些禽病的诊断？
３、 用鸡血清进行琼 扩试验，应用什么浓度NaCL 的琼 脂板？
４、 琼扩试验的原理是什么？
５、 琼脂平板的保存应注意什么问题？
五、 示教试验：MDV单抗分型鉴定（IIF）
注：鸡传染性法氏囊病（IBD）的琼扩诊断是取待检鸡血清与传染性法氏囊病诊断抗原作琼扩试验，其原理和操作方法同MD 的血清琼 扩试验。
实验七 沙门氏菌快速检验试验
一、 目的
了解沙门氏菌快速检验的方法和原理；
掌握FA和ELISA的操作步骤
二实验器材
使用仪器、器械、试液，请参阅前述有关章节模拟待检样品
三实验步骤
（一） 直接免疫荧光试验检测沙门氏菌
１、 取胜模拟样品增菌培养物10ml，于载玻片上涂成2cm（）面积的薄膜，空气干燥。
２、 以4℃或…20丙酮固定涂膜，室温10—15分钟，晾干。
３、 加染荧光抗体（FITC标记兔抗菌素沙门氏菌血清或O 抗菌素原单抗），37℃45分钟。
４、 PBS PH7。4 0。01M搅拌下洗涤10分钟；晾干。
５、 于荧光镜下镜检，阳性样品在细菌四周有特异性黄绿色荧光，而阴性样品未见黄绿色荧光。
（二） 单抗夹心ELISA试验检测沙门氏菌
１、以方阵试验确定单抗包被浓度和酶标制剂的使用浓度。
２、以pH9。6碳酸盐缓冲液包被单抗，100ul/孔，4℃过夜，或37℃2hr。
３、PBST洗涤三次。
４、以10％CFS…PBS封闭37℃3hr。
５、PBST洗涤三次。
６、加模拟样品增菌液，100ul/孔；室温15分钟。
７、PBST洗涤三次。
８、加新配套OPD底物缓冲液，100ul/孔；室温15分钟。
９、2M HSO终止反应（100ul/孔）。
10、加新配OPP底物缓冲液，100ul/孔，室温15分钟。
11、2M H2SO4终止反应（100ul/孔）
12、肉眼判定或测定OD496值。
（三） 示教试验 沙门氏菌O…I噬菌体裂解试验。
实验八 鸡白痢的诊断
一、 目的
掌握快速全血平板凝集反应并用来诊断鸡白痢。
二、实验器材
小搪瓷盘 铁丝环 滴管 玻璃板 干净纱布 24号针头 7号针头 灭菌大平皿
生理盐水 鸡白痢凝集抗原液
三、实验步骤
（一） 快速全血平板凝集试验
１、 将鸡白痢诊断抗原液充分振荡混匀，用滴管吸取抗原滴2滴于玻板上。
２、 一人保定鸡，另一人用7号针头刺破被检鸡的翅静脉使其出血。
３、 用铁丝环沾取一滴环血液与玻板上的抗原液搅拌均匀，并涂开至直径约1。5cm大小的涂面。
４、 25℃时，于2分钟内出现明显的凝集颗粒或凝集片则为阳性反应。
（二） 示教实验
１、 鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定；
２、 间接血凝试验；
３、 琼脂扩散沉淀试验；
４、 抗体竞争ELISA试验。
注：鸡慢性呼吸道病的现场诊断是慢性呼吸病平板凝集抗原与受检全血做凝集试验。操作方法同鸡白痢的快速全血玻板凝集实验。
