实验室手册-第10节
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种樱�4℃存放备用。（有市售产品，Sigma）
3、免疫原的配制 取等体积的蛋白质溶液与福氏完全佐剂或不完全佐剂分别置于二支洁净灭菌试管中，用2—5ml注射器（配5号针头）吸取约1/5V的抗原溶液，将针头插入佐剂液面下，急速注入油层。置旋涡器上充分混合。用同样的方法分4—5次将其余的抗原溶液与佐剂混合。再于涡旋器混匀30分钟，然后再用注射器反复抽吸，配成油包水“颗粒”，静置15分钟后，观察管底部有无水相析出，如有水相析出，则再用注射器将水相注入油层，并混合之。
制成的油包水乳剂在免疫动物之前需检查其乳化效果，方法是：取一只烧杯装满水，滴数滴上述乳剂于水面，第一滴通常分散开而其他滴呈球状。如也分散开则表明不是油包水乳剂。
3、 一些抗原，如全菌抗原、颗粒抗原等，可以不使用佐剂而直接免疫动物。
二、 动物的选择
免疫动物的选择应考虑以下几方面因素：
1、 动物房的条件及饲养管理水平。
2、 抗血清的需要量：1只小鼠仅能提供1。0—1。5ml血；而一只山羊能提供几升。
3、 可能提供的抗原量：小鼠通常对50ug或小于50ug的抗原应答良好，山羊可能需要几mg。
4、 应考虑提供抗原的动物与产生抗体的动物之间的种系关系。多数情况下，应选用在种系上与抗原供者无关的动物来进行免疫。如高度分化的哺乳动物的蛋白抗原应选用非哺乳动物（如鸡）来生产抗血清。
5、 特别注意的是，如果所制备的抗体仅仅是用来检测蛋白质间的微细差异，如同种异型，则可用关系相近的甚至是同种动物来分离抗原和制备抗体。
6、 此外，还应考虑所选动物的年龄大小、性别、个体差异等对抗血清生产的可能影响。因此免疫动物只数不宜仅是1只。
三、 免疫程序的选择
（一） 山羊抗小鼠、兔、猪和鸡Ig免疫血清的制备。
程序一：
1、 每只山羊于两侧肩前淋巴结各注射0。5毫升（共含蛋白质量650—1000ug，混于FCA中，FCA—Ag）。
2、 1个月后，采血测效价，如琼凝扩效价未达1：32，则用二倍剂量抗原（混于FIA中，FIA—Ag）于颈部肌肉注射以加强免疫。
3、 2周后再试血，如效价仍未达到1：32，则再加强免疫（同2），直至达到1：32以上。
4、 颈动脉放血致死，分离血清，分装，—20℃保存。
成功范例：羊抗鸡血清。
附：琼脂扩散沉淀法测定血清效价。
（1） 1％琼脂凝胶：用含0。065％ NaN2、5Mmedta—Na2的0。01MPBS（PH7。4）配制1％琼脂。
（2） 抗血清以0。01MPBS（PH7。4）作1：2—1：256稀释后，加入周围孔，每一稀释度加二孔。中央孔加提取的抗原。
（3） 37℃湿盒内过夜扩散，观察结果。
程序二：
1、 每只山羊于足掌、足趾、后腿部皮下注射2mlFCA—Ag（共含蛋白质量1。2mg）。
2、 二周后，二侧腘淋巴结内注射1mlFIA—Ag（蛋白质量为0。6mg）。
3、 二周后，后腿部肌肉注射4ml FIA—Ag。
4 、二周后试血，判定标准同上。若达不到效价，继续后腿部肌肉注射4mlFIA— Ag
直至达到1：32 以上。
5、颈动脉放血致死，分离血清，分装之，—20℃
成功范例：羊抗兔血清（1：256）。
程序三：
1、 每只山羊背部皮内多点注射6mlFCA—Ag（每点30—50ul，共含蛋白质量600ug）。
2、 1个月后，颈部和后腿部肌肉注射4mlFIA—Ag（蛋白质量用400ug）。
3、 二周后试血，若效价达不到，同2继续加强免疫，直至效价达1：32以上。
4、 采血，贮存同前。
成功范例：羊抗BALB/C小鼠血清。
程序四：
1、 每只山羊颈部、腿部皮下注射4mlFCA—Ag（共含蛋白质4mg）。
2、 二周后，颈部、腿部肌肉注射4mlFIA—Ag，二周后，同法加强免疫一次（6mlFIA—Ag）。
3、 二周后试血。若效价不够，继续加强免疫，直至效价达1：32以上。
4、 采血并分离血清，贮存同前。
成功范例：羊抗猪血清
（二） 兔抗血清的制备
程序一：
1、 每只家兔上内多点注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1个月后，用提纯抗原静脉注射0。5mg蛋白抗原。
3、 2周后试血；效价不够；可加强免疫一次。。
4、 于最后一次免疫2周后，心脏采血致死，分离血清，分装—20℃冻存备用。
成功范例：兔抗大肠埃希氏菌粘附素血清
程序二：
1、 第一次静脉、腹腔各注射50mg/只差速离心粗提NDV抗原。
2、 第7天重复注射一次。
3、 第14天改为腹腔、肌肉注射器，剂量加倍。
4、 第21天肌肉注射100mg/只，四脚掌各10mg/只。
5、 末次注射后10天采血，分离血清。测HI滴度计算血凝抑制单位。
（三） 鸡抗NDV血清制备
第一次用Lasota株鸡胚尿囊液静脉注射1ml/只，腹腔注射4ml/只，以的每隔5天重复注射二次（内含1mlNDV强毒鸡胚尿囊液），共三次，末次注射后第10天采血，测HI滴度。
（四） 小鼠抗血清抗原的制备
程序一：可溶性抗原的免疫程序
1、 以10—100ug抗原乳化在200ulFCA中（油包水），腹水注射3—12周龄BALB/C小鼠。
2、 4—6周后，以同样剂量抗原乳化在FIA中，作1—2次追加免疫（i。p），间隔时间为2—3周。（可试血、采血）。
3、 以等量或加倍量抗原的PBS 溶液作最后一次免疫，2—4天后取脾细胞可作融合试验用。
程序二：细胞性抗原的免疫程序
1、 细胞用PBS洗3—4次以除去血清成分。
2、 以10（7）细胞/只剂量腹腔注射BALB/C小鼠。
3、 3—8周后作追加免疫力。（可重复1—2次）。
4、 最后一次免疫2—4天取脾细胞供作融合。
程序三：短程免疫程序
1、 全菌抗原5X10（6）/只腹腔注射；（或用提纯抗原40ng/只 i。p）。
2、2—3周后，腹腔注射提纯抗原40ng/只（若每间隔2—3周用全菌抗原后提纯抗原加强免疫5—6次，此乃“密集型”免疫程序）。
2、 3天的取脾细胞可供融合用。
（五） 体外免疫程序
Development of a serum—free medium for in vitre immune responses by using b—cyclodextrin
J Immunol Methods 1998：112：227—233
（六） IBDV血清生产（从略）
第十章 细菌学试验中的几个常用技术
第一节 ；菌总数估测
一、 比浊法
1、 莫法兰德浊度计的制备
按下述方法制备标准硫酸钡悬液。
（1） 制备一份1％的C。P（化学纯）硫酸溶液。
（2） 制备一份1％C。P氯化钡溶液。
（3） 制备下述10个标准悬液：
加（1％氯化钡溶液ml数）于（1％硫酸溶液ml数）
1 99
2 98
3 97
4 96
5 95
6 94
7 93
8 92
9 91
10 90
（4） 取各标准硫酸钡沉淀的悬液3ml左右，封存在一支试管内。试管必须仔细挑选，使其直径、色泽和管型的厚度都一致。
2、 目测待检样品与几号管浊度相近，并按下列关系，估计细菌浓度：
管号 细菌含量
1 3亿
2 6亿
3 9亿
4 12亿
…… ……
二、 常规平板计数法
1、 将待测均质样品制备10（…2）10（…3）10（…4）……等适度的十进制稀释液，其方法系以无菌吸管吸取10ml原稀释液，加于90。0ml稀释液中（有时可采用1。0ml＋9。0ml）混匀。注意：稀释每个滴度的吸管都要更换，操作中防止出现泡沫。
2、 用吸管以每一个稀释液内吸取1。0ml，分别加入到有适当标志的平皿（15mm X100mm）内。注意：如果稀释菌液静置的时间超过3分钟，则在吸取前，必须重新混匀。
3、 于每个平皿内各加12…15ml标准法琼脂（冷至44…46℃。琼脂在45℃水浴中保温备用）样品的每一个稀释系列做一个只加稀释剂倾注琼脂的对照平板。
4、 立即转动或在一个平面上前后倾动平皿，使样品稀释液和琼脂培养基充分混合均匀。
5、 待琼脂凝固后，翻动平板，迅速防于35℃恒温箱内培养 48h＋（…）2h。
6、 培养后，在适当范围的双列平板用菌落计数器计数菌落数，记录每一个稀释度的平板计数结果。
7、 在三个稀释倍数中，至少应有一个稀释倍数的两个平板其菌落数在30—300个的范围之内。根据菌落数和稀释度计数样品中的需要平板数。
8、 所有从菌落数少于30个或多于300个的双列平板计算而得的需氧平板计数数，都报告为估算数。
附：1、标准法琼脂（平板计数琼脂）
胰蛋白胨 5g
酵母浸膏 2。5g
葡萄糖 1g
DW 15g
PH7。0＋（）0。1 121℃15分钟
2Butterfield氏缓冲液
基础溶液：
磷酸二氢钾 34g
D。W。 500ml
用1N氢氧化钠将PH值调整至7。2，加蒸馏水至升。121℃高压灭菌15分钟，贮于冰箱。
稀释的定量瓶装（使用液）：
取上述基础液1。25ml；加D。W。达1000ml；分装于瓶内；每瓶99或99＋（）1ml。
121℃高压灭菌15分钟。
三、 直接显微镜检查法（Official first action method，法定试行方法）。
1、 在油镜下用显微镜测微尺测定每个视野的直径d，则视野的面积为：
Af=（）（d/2）（）。
2、 每一平方厘米涂膜的视野数应为
AF 1cm（）
——— =——————
Af Af＇cm＇（）
3、 每个涂膜含0。01ml样品；则1。0ml样品的视野数应为：
AF
FF=100X————
Af
4、 每ml样品中的菌数即为：
DMSCC（）/ml=＇FF＇X＇每个视野的平均菌数＇
（direct microscopic somatic cells count 直接显微镜菌体细胞计数）
5、 FF和检查的视野数（至少10—60个）都为已知数，故可作为一个系数，称视野工作系数（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=＇FWF＇X计数的总细菌数
6、 菌液涂膜的制备：
（1） 吸0。01ml样品；置于洁净、干燥的载玻片上；
（2） 将菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3） 将玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4） 浸于二甲苯中1min，再浸于95％酒精中1min；
（5） North苯胺油亚甲蓝染色剂中染色1—20min；
7、 漂洗玻片，镜检前在空气中充分干燥。切忘用吸墨纸吸干。
附：North苯胺油—亚甲蓝染色液
苯胺油（Aniline Oil） 3ml
酒精（95％） 10ml
盐酸（浓） 1。5ml
亚甲蓝（饱和溶液） 30ml
蒸馏水；加至 1000ml
将3ml苯胺油与10ml酒精相混合；在不停在搅拌下徐徐加入1。5ml盐酸。。加30ml饱和亚甲基蓝溶液，用水稀释至100ml，过滤。
四、 分光光度计测定法
a、 波长选择420nm，550nm，600nm。
b、 下列回归方程为420nm条件下建立。
第一组
（1） 大肠杆菌
lgy（）=7。1370＋2。7878X
（2）金黄色葡萄球菌：
lgy（）=7。4722＋4。7259X
（3白色葡萄球菌：
lgy=6。9067＋2。6950X
（5） 白色念珠菌：
lgy=5。9512＋2。1948X
有效测定范围在103___106ofe/ml
（摘自俞晓峰文章）
第二组
（1） 沙门细菌（S。pullorm）
未离心肉汤：lgy=7。3461＋7。5306X
离心菌悬液：lgy=7。3112＋7。7191X
（2） 大肠杆菌：
未离心肉汤：lgy=7。4197＋1。2113X
离心菌悬液：lgy=7。3764＋5。8632X
五、最近似数（MPN）（the most probable numbers）是一个代表作用物中活菌浓度的估计数。这个数是应用机率的原理测定作用物（样品）中细菌的总浓度而推知的。请参阅有关文献。
第二节 几种常用细菌培养基的配方
一、Minca Med 1000ml（Minca—Isoritalex）
KH2PO4 1。36g
NA2HPO4。12H2O 25。3g（NA2PO4。12H2O 10。1g）
Casamino acids 1g （Difco）
Trace salts solution’ 1ml’
agar（Difco） 12g
PH7。5 10P。10分钟消毒
（Isoritalex（BBL）：1 ampoule）
