诊断学第七版教材-第113节
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变的检测。
（2）基因连锁分析：临床的一些疾病的致病基因尚不清楚，很难用基因突变的检测诊
断。因此对这些遗传疾病采用基因连锁分析。
（3）基因表达分析：如mRNA定量检测及mRNA长度分析等。mRNA检测在基因
表达水平上为基因功能是否正常提供了直接依据。
（4）病原体诊断：即外来入侵病原微生物遗传物质的检测。
二、基因诊断在诊断学中的位置
传统的疾病诊断方法主要是以疾病的表型改变为依据，如症状、体征、物理检查、实
验室检查，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，同一种表型可能在多种疾病中出
现，而且表型往往在疾病发生一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。研究
发现各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。
基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状
态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测，特别对确定有遗
传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
三、基因诊断的常用技术
分子生物学技术是基因诊断的主要技术。近年来随着分子生物学技术日新月异，以核
酸分子杂交和聚合酶链反应（PcR）为核心发展起来了多种方法已被广泛用于基因诊断，
如PcR一单链构象多态性（single strand conformation p01ynlorphism，sscp）、限制性片段
多态性（restriction fragment length polymorp｝fism，RFI。P）、等位基因特异性寡核苷酸分
第十章其他检测
析（allele—specific 01igonucleotide，ASo）、基因芯片技术（gene chip）、逆转录POll（re—
vei‘se transcr’iption—PCR）、SotJthern印迹杂交（Sotlthern blotting）、No r。them印迹杂交
（Nm’thern blotting）、斑点杂交（dot blotting）和原位杂交（in situ hybridization，
ISt｛）等。
（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则
退火形成双链的过程。它是研究核酸结构与功能的常用技术。杂交的双方是探针与待检核
酸，杂交后形成的双链分子称为杂交分子（DNA—DNA、DNA—RNA或RNA—RNA）。
分子杂交的方法多种多样，其共同点是：①应用了核酸序列的复性原理；②都采用了标记
探针。探针就是同位素或非同位素（如：生物素或荧光染料等）标记的短片段特异DNA
或RNA。常用的核酸分子杂交技术有：
1．SotJthem印迹杂交 Sotlthern印迹杂交又称DNA印迹，是英国科学家Sot】thern
于1975年发明的一种特定检测DNA片段的方法。其基本原理是：将基因组DNA用一种
或几种限制性内切酶消化成大小不同的片段，消化后用电泳的方法将这些DNA按大小不
同进行分离，分离后通过原位变性，将其转印到固相支持物上，如：硝酸纤维素薄膜，再
应用特异的同位素或非同位素标记的DNA或RNA探针进行杂交，然后通过对杂交信号
的检测来确定探针互补条带的位置。基因的缺失或突变可能导致带的缺失或位置改变。
Sotlthern印迹的转印方法有毛细管虹吸印迹法、电转法、真空转移法。
Sot…theI。n印迹杂交的主要步骤是：从细胞中分离提纯基因组DNA一用限制酶消化基
因组DNA获得长短不同的酶切片段一通过凝胶电泳将这些片段按大小分离一将凝胶上的
DNA片段变性后原位转移到固相支持物上一用放射性核素或非放射性核素标记的探针与
之杂交一通过放射自显影或相应显色方法显示杂交信号。
SoL？theI’n印迹杂交在其他分子生物学方法出现之前曾广泛用于科研和临床诊断中。临
床上主要用于进行疾病的RFLP连锁分析、基因缺失诊断。现在一些动态突变疾病的诊断
也可先用PCR扩增后再通过Sot…thel’n印迹杂交来进行。由于DNA印迹杂交技术相对较
烦琐，需要的DNA量较大（一边需要1～5肛g），在取材量受限的疾病诊断中已被其他方
法如PcR取代。
2．Nor’them印迹杂交 Northern印迹杂交是一种研究RNA的方法，可用于测定细胞
的总RNA或mRNA分子量的大小。其基本原理和基本过程与Southern杂交相似，不同
之处在于：①Norther‘n印迹杂交检测的对象为RNA，而SotIthel？n印迹杂交检测的是
DNA。②Nor’thern印迹杂交是在RNA电泳前对其进行变性，并在电泳时加入变性剂，使
RNA电泳时保持变性状态，而Southern印迹杂交是在电泳后进行变性。
3．斑点杂交 斑点杂交（dot blotting）即狭缝杂交，其基本原理将被检样品点到一
张硝酸纤维素膜上，烘烤固定，预杂交后，经中和、洗脱、干燥，再将其和探针放入复性
缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。若杂交样品为RNA需在
点样前对RNA进行变性后再进行点样，若为DNA在点样后对膜进行变性处理。斑点杂
交是一种快速、简便、既可检测DNA又可检测RNA的方法，可同时检测多个样品，既
可进行定性还可以进行半定量。这种方法可初步探测被测样品中是否含有一种特殊的基因
或序列，且可用来分析样品之间的同源性。
4．原位杂交 原位杂交（in situ hybridization，IsH）就是在保持细胞基本形态的情
况下，用放射性核素或非放射性核素标记的探针与细胞内的DNA或RNA进行杂交。若
探针是同位素标记，杂交后需用X光片进行放射自显影，然后观察曝光点在组织或染色体
分裂象上的相对位置。若探针用荧光标记，杂交后用荧光显微镜直接观察，现已发展了多
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色荧光技术，因此可同时检测多种DNA或RNA的情况。原位杂交由于是原位检测，因
此在对特定DNA或RNA进行检测的同时还可对其进行细胞及基因组内定位。
（二）DNA测序
DNA测序（DNA seq？aenc…ing）即DNA一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要
的技术。由于临床上进行各种突变分析的最终目的是获得突变信息，即确定具体的突变类
型，因而不管先通过何种方法进行突变筛查，最终都会落实到DNA测序上。DNA测序能
直观地反映出DNA序列的变化，因此是诊断未知突变基因的最直接的方法，在遗传病和
肿瘤的诊断、法医学的鉴定中具有非常重要的意义。DNA序列测定常用方法有以下3种：
1．双脱氧链终止法 目前应用最多的快速测序技术是Sangei‘等1977年提出的双脱氧
链终止法（chain termination melthod）。双脱氧链终止法的基本原理是：DNA聚合酶利用
单链DNA作为模板，准确合成互补DNA链，它不仅可以以单脱氧核苷酸（dNTP）为底
物，而且可以以双脱氧核苷酸（ddNTP）为底物，ddNTP若在合成过程中3 L末端掺入了
ddNTP，DNA链的生长将会被终止，因此生成一系列不同长度的DNA片段。其基本操
作步骤‘（图4—10一1）：共设4个反应管，各管中同样加入DNA模板、DNA聚合酶、放射
性核素szP标记的引物、4种dNTP，将四种不同的ddNTP（ddATP、ddTTP、dd（＇TP、
dd（：TP）分别加入相应管进行温育，将四管反应产物平行加到同一变性凝胶上作电泳分
离，通过放射自显影术可获得一系列全部以3，_末端ddNTP为终止碱基的长度不等的
DNA片段的电泳谱带，通过电泳谱带可直接读出DNA的核苷酸顺序。
图4—10一1 双脱氧链终止法DNA测序
2．化学降解法 化学降解法（chemical degradation seqLlencing）由Maxam&Gibert
于1977年提出，其原理是不同的碱基（G，A＋G，C＋T，C）可被不同的化学试剂特异
地修饰，使相应的糖苷键变得不稳定，造成碱基的特异性切割，产生四组不同长度的
DNA链的反应混合物，反应后经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影也可读出DNA的序
列。常用的化学试剂有硫酸二甲酯和肼。化学降解反应包括碱基的修饰、将修饰的碱基从
其糖环上脱落、DNA在失去碱基的糖环处断裂。化学法的优点是模板不需体外酶促反应，
只要末段标记的DNA片段，无论单链或双链，分别标记3’端和5’端可进行双侧读取检测
短的寡核苷酸片段；其缺点是方法复杂费时，末段标记比活性低。
3．自动测序技术 自动测序技术采用自动化测序仪进行，其原理同双脱氧链终止法。
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故其作为一种有效的 扩增和检测技术具有很好的发展前毒：“。驯兀哥。w以进z甲’
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（五）单链构象多态性分析
单链构象多态性（single strand conformational polymorphism，SS（：P）分析是一种分
析突变基因的方法。其基本原理是单链DNA在非变性的情况下具有一定的空间构象，这
种构象是由于DNA内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当DNA中一个碱基突
变时，其空间构象会发生改变，空间构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进
行电泳时受到的阻力不同，因此通过非变性凝胶电泳可将构象不同的分子分离开，从而对
突变基因进行检测。现SS~：P多与PCR技术联用（PCR—SS（：P）检测基因突变，提高了
基因突变检测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。
（六）限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性（restriction fragment length p01ymorphism，RFLP）分析是
限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针一杂交技术的综合应用，多用于临床遗传性疾
病的基因诊断。其基本原理是限制性内切酶可特异识别DNA碱基序列并对其进行切割
（如EcoR工识别GAATTc序列并对其进行切割），当碱基发生改变时（如遗传性疾病、
肿瘤等多有基因的缺陷），造成新酶切位点的形成或旧酶切位点的消失等，从而引起限制
性内切酶酶切后的DNA片段长度差异，称限制性片段长度多态性。RFLP作为第一代遗
传标记已经广泛地应用于遗传病的连锁分析。根据这些广泛存在的遗传标记，应用定位克
隆策略已成功地确定了100多种以孟德尔遗传方式为主的遗传病基因。同时，RFLP还可
用于基因组同源性分析以及个体识别，后者在法医学中已成为常规手段和方法。
（七）单核苷酸多态性分析
单核苷酸多态性（single nucleot：ide．polymorphis，SNP）主要是指在基因组水平上由
单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，
在人群中的发生率大于1％。SNP有单碱基的转换、颠换、插入、缺失等形式，但更多的
是单个碱基的置换。现今，人们认为基因组中的这类多态性有助于解释个体间的表型差
异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病易感性的差异，以及对各种药物的耐受性
和对环境因素反应不同。SNP作为一种遗传标记具有以下特性：
（1）密度高：它在基因组中的分布比微卫星标记广泛，可以在任何一个待研究基因的
内部或附近提供一系列标记。
（2）具有代表性：某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质的结构或表达水
平，因此它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点，可能代表疾病遗传机理中的某
些作用因素。
（3）遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性，
尤其是处于编码区的SNP（cSNP）。SNP一般只有2个等位基因，即是二态的，故又称双
等位基因标记（bialleic：marker…），其在任何人群中的等位基因频率都可估计出来。
（4）分析易实现自动化：由于SNP是双等位基因标记，容易进行自动化批量检测，
分析也相对简单，不需要像检测RFLP及微卫星多态标记那样进行片段长度的测量。缩短
了研究时间。目前已有多种方法可用于sNP检测，如根据DNA阵列的微测序法、动态等
位基因特异杂交、寡聚核苷酸特异连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。不管哪一种方
法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其他检测。
（八）基因芯片技术
基因芯片（gene chip）通常指DNA芯片，其基�
