诊断学第七版教材-第107节
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鉴定系统快速简便鉴定分离菌。在鉴定细菌的同时，需做抗生素药物敏感试验。
2．不能人工培养的病原体感染性疾病 将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养。
接种动物后，可根据动物感染范围、动物发病情况及潜伏期，初步推测为某种病原体。接
种于鸡胚的病毒，根据不同接种途径的敏感性及所形成的特殊病灶，有助于初步鉴定。细
胞培养的病毒，可依据细胞病变的特点或红细胞吸附、干扰现象、血凝性质等缩小病毒的
鉴定范围，最后用血清学方法作最后鉴定。
（五）血清学实验
用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。人体感染病原体后
经过一定时间产生特异性抗体。这种抗体在体内可维持数月或更长时间，因而检测抗体不
仅可用于现症诊断，而且还是疾病追溯性调查的一种方法。血清学诊断对于某些病原体不
能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据，但是，抗体检出最早也需在感染4～5天
以后，一般在病程2周后效价才逐渐增高，因而它不适于疾病的早期诊断。在作血清学诊
断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2～3份检查，如抗体效价在病程中呈4倍
以上增长者有现症诊断价值。若每次抗体效价无变化，则可能是因为隐性感染或回忆反应
所致，而不能做现症感染的诊断。单份血清一般诊断意义不大，除非检测IgM。病人血清
内IgM的检测有重要意义，不仅可做早期诊断，而且可区分原发性感染和复发性感染，
前者急性期血清检出IgM，而后者为IgG。常用的血清学检测方法有凝集试验、沉淀试
验、补体结合试验、间接免疫荧光技术、放射免疫测定、酶联免疫吸附试验等。血清学诊
断试验的价值常用敏感性、特异性和预测值来评价。临床医生必须合理选择试验项目达到
确诊某一疾病、排除某一疾病或监测疾病治疗的效果（表4—9—1）。
表4—9—1 病原体检测方法、判断和速度
第二节 病原体耐药…陛检测
抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，它的发现、研制和临床应用是现代医学史
上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病。但抗微生物
药物的广泛使用所造成的“抗生素压力”（antihiotic pressure）也使原来占优势的敏感菌
株被抑制和杀灭，原来是少数劣势的固有耐药菌株或诱导出的获得耐药菌株则繁衍成抗菌
药物主要使用环境（如医院、诊所内）的优势菌株，使临床医学在感染控制上面临严重的
挑战。了解耐药发生机制和耐药性监测，熟悉常见耐药菌株的耐药特点，是临床医学生的
一个重要任务。
一、耐药性及其发生机制
（一）耐药病原体
目前临床感染的病原微生物以革兰阴性菌居多（约占六成），主要是铜绿假单胞菌、
大肠埃希菌、克雷伯菌和肠杆菌属细菌等，主要耐药类型有以p一内酰胺酶介导的耐p一内
酰胺类抗生素的革兰阴性杆菌；质粒介导的产超广谱B一内酰胺酶（extra—spect…rum bet？a
lactamase，ESBL）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等；染色体编码产生工类8一内酰胺酶的
阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等；另外多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆
菌属细菌等都已成为临床上感染性疾病治疗的棘手问题。革兰阳性菌引起的感染约占三
成，以葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和血浆凝固酶阴性的葡萄球菌）和肠球菌为主，重要的
耐药菌株有耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistant staphy．10cct】s，MRs）、耐青霉素肺
炎链球菌（penic川in reSl’stant streptc）COCCIJs pnetlm（）nia，PRSP）、耐万古霉素肠球菌（va—
comycin resistant enteroc（）CCLts，VRE）和高耐氨基糖苷类抗生素的肠球菌等。不仅细菌可
产生耐药，病毒也出现了耐药病毒株，导致抗病毒治疗逃逸现象发生。如HBV发生突变，
对核苷类似物药物（如lamivudine拉米夫定和famciclovir华美可维等）产生耐药。
（二）耐药机制
对某种抗菌药物敏感的细菌变成对该药物耐受的变异称为耐药性变异。细菌的耐药性
变异已成为当今医学的重要问题。细菌耐药性的获得可以通过细菌染色体耐药基因的突
变、耐药质粒的转移和转座子的插入，使细菌产生一些酶类（灭活酶或钝化酶）和多肽类
物质，通过下述几种机制导致细菌耐药：
1．细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统 整合子（integrOil）是捕获外源基因
并使之转变为功能性基因的表达单位，通过转座子和接合质粒在细菌中传播的遗传物质。
整合子的基本结构由1个编码整合酶（integrase）的IntI基因、2个基因重组位点attI和
attc、启动子和耐药基因盒组成。目前已确定有60多个耐药基因盒，常见的有：①aad基
因盒：编码氨基糖苷类的耐药性。②dfr基因盒：编码甲氧磺胺嘧啶类的耐药。③编码0一
内酰胺酶和超广谱p～内酰胺酶。④其他基因盒：cat基因编码对氯霉素的耐药；aac：基因
编码对氨基糖苷类的耐药；aar基因编码对利福平的耐药；ere基因编码对红霉素的耐药。
2．产生灭活抗生素的水解酶和钝化酶等 常见的有：①ESBI。s：由质粒介导的、能赋
予细菌对多种p一内酰胺类抗生素耐药，它主要由革兰阴性杆菌产生。②AnlpO p一内酰胺
酶（AmpC p—lactamases）：是革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的丝氨酸头孢菌素
酶组成的一个酶家族，几乎对所有的口一内酰胺类药物耐药。③碳青霉烯酶：碳青霉烯酶
主要水解碳青霉烯类抗生素，表现为对碳青霉烯类抗生素高度耐药。按Ambler分子分类
为A、B、D 3类酶，A类酶见于一些肠杆菌科细菌，D类酶仅见于不动杆菌；B类酶为金
属酶，见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌。④氨基糖苷类钝化酶：是细菌对氨
基糖苷类抗生素获得性耐药的主要机制，通过质粒介导能使氨基糖苷类抗生素失活。
3．细菌抗生素作用靶位的改变靶位结构的改变，是引起细菌耐药的一个重要因素。
如MRS是由于染色体上？…Fie（：A基因编码产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP2a），以至
青霉素不能抑制细菌细胞壁的合成；VRE的耐药是由于细菌染色体的改变，编码产生的
酶导致与万古霉素作用的靶位改变；大肠埃希菌DNA拓扑异构酶Ⅱ的gryA基因突变，
可造成对喹诺酮类中所有药物交叉耐药等。
4．细菌膜外排泵出系统 细菌依靠主动外排泵出机制来减少细菌内药物浓度，如铜
绿假单胞菌有3套外排泵出系统，MexAB—oprM、MexCD—oprJ、．MexEF—oprN等。
5．细菌生物膜的形成 细菌生物膜（biofilm，BF）是指附着于有生命或无生命物体
第九章 临床常见病原体检测
表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。与浮游菌相比，生物膜中细菌对抗生索
的耐药性可提高lo～1000倍，其耐药性主要取决于其多细胞结构：①生物膜中的胞外多
糖起屏障作用，限制抗生素分子向细菌运输。②生物膜中微环境的不同可影响抗生素的活
性。③诱导细菌产生特异性表型。④多菌种的协同作用。具有生物膜的细菌多见于铜绿假
单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变异链球菌。
细菌的多种耐药机制可协同作用，导致多耐药菌株的出现。
二、检查项目、结果和临床应用
常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法
和E试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、
基因检测等方法。
（一）药物敏感试验
1．K—B纸片琼脂扩散法（Kirby—Bauer disc agar diffusion method） 世界卫生组织
推荐的标准纸片扩散法，是由Kirby和Bauer建立的。将含有定量抗菌药物的纸片贴
在接种有测试菌的M—H琼脂平板上置3 5℃孵育16～18h。用游标卡尺量取纸片周
围透明抑菌圈的直径，参照CLSI（Clinical and Laboratory Standard Institute）标准判读
结果，按敏感（susceptible，S）、中度敏感（intermediate，I）、耐药（resistant，R）
报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭；
I：测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物
浓集部位的体液（如尿）中被抑制；R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗
菌药物浓度所抑制。
2．稀释法稀释法所测得的某些抗菌药物抑制检测菌肉眼可见生长的最低浓度称为
最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），有肉汤稀释法和琼脂稀释法两
类，前者为临床实验室常用的一种定量试验。先以水解酪蛋白液体培养基将抗生素作不同
浓度稀释，再种入待检菌，置35℃孵育24h后，以不出现肉眼可见细菌生长的最低药物浓
度为该菌的MIC，参照CLSI标准判读，结果按敏感和耐药报告。
3．E试验 是结合稀释法和扩散法原理和特点而设计的一种操作简便（如同扩散法）、
精确测定MIC（如同稀释法）的一种方法。在涂布有待测试菌的平板上放置1条内含干
化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的商品化抗菌药物塑料试条。35℃孵育16～18h
后抑菌圈和试条横向相交处的读数刻度即是待测菌的MIC，参照CI。SI标准判断耐药或敏
感。由于药物塑料试条价格较贵，目前尚未在临床广泛使用。
4．耐药筛选试验耐药筛选试验是以单一药物、单一浓度检测细菌的耐药性，临床
常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平耐药的肠
球菌。
5．折点敏感试验 折点敏感试验是仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药折点
MIC）而不使用测定MIC时所用系列抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性。当选择区分
中介和耐药折点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养基均生长，可判断为耐药；如在
2种药物浓度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度培养基中生长提示为中介。
（二）耐药菌监测试验
1．耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的筛选测定 包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
（MRsA）和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCoN），是目前导致医院感染的重要病
原菌。此类葡萄球菌具有多重耐药性，即对全部0一内酰胺类抗菌药物，包括青霉素族和
头孢菌素族以及临床常用的其他多种抗菌药物均耐药。因此，此类葡萄球菌的早期检出和
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确定具有重要临床意义。检出方法可用添加有4％Na（：1和6sag苯唑西林／ml培养基的M—
H琼脂进行筛选测定。测试菌的准备和接种方法同纸片扩散法药敏试验，用1“l接种环接
种或棉拭点种，接种菌量为10。CFu／点。35℃孵育24h，有菌落生长者即为MRS。同时
以标准菌株金葡菌ATCC29213、金葡菌ATcC38591以及已知为阳性的MRS菌株作质控
菌株。
2．氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定 对多种抗菌药物包括氨基糖苷类呈
固有耐药是肠球菌的特点，故单用氨基糖苷类治疗肠球菌感染无效。但如与一种作用于细
胞壁的抗菌药物如青霉素类合用，则可发生协同作用而增强杀菌效力。如果肠球菌对氨基
糖苷类产生了高耐药性，这种联合应用就会无效。所以及时筛选出肠球菌中氨基糖苷类高
耐药株，有助于临床调整和重新确定治疗方案。其检测可采用纸片扩散法和肉汤稀释法。
当对庆大霉素纸片（120／xg／m1）的抑菌圈直径≤6mm时可判为耐药；当抑菌圈直径在7～
9mm时，I可进一步采用肉汤稀释法或E试验测定MIc以确定是否为耐药。以
ATC（229212和ATCC51299为质控菌株。
3．耐青霉素肺炎链球菌（PRSF’）的筛选测定 为早期及时筛选出此类肺炎链球菌可
采用1pg苯唑西林纸片筛选法。测试方法同纸片琼脂扩散法，培养基用含5％羊血的M—
H琼脂。如抑菌圈≥20ram，则测试菌对青霉素G敏感，如抑菌圈≤19mm，则提示该菌
可能对青霉素耐药或中度敏感，需用稀释法或E试验进一步做青霉素G的MIc测定。质
控菌株采用肺炎链球菌ATcc
